NobleRyder RP9988 通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

產(chǎn)品貨號：RP9988

產(chǎn)品名稱：通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

英文名稱：Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

產(chǎn)品別名：通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：25T/50T/100T

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) 核酸電泳

產(chǎn)品簡介：

儲存條件：Store at -20℃，1 year.

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

NobleRyder RP9988 通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) 本試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴增。它采用M-MLV進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實驗。本試劑盒中配制的酶均為進口的酶。RT酶采用進口的M-MLV，所以cDNA更長，基因的信息保留得更完整！反轉(zhuǎn)錄過程中特異的RNase抑制劑可有效降低由于外源RNase污染而導(dǎo)致實驗失敗的風險。本試劑盒使用方便、快捷，可廣泛用于cDNA克隆及目的基因檢測等分子生物學實驗。

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)產(chǎn)品簡介

莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）是一種RNA依賴的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）轉(zhuǎn)錄為cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相對于禽成髓細胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶較弱，更適合用來反轉(zhuǎn)錄較長的mRNA。M-MLV RT應(yīng)用于以RNA為模板合成cDNA的第一條鏈。

注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，因此要得到和用AMV 反轉(zhuǎn)錄酶一樣產(chǎn)量的cDNA需加入更多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)使用方法

1）使用方法簡介以用2mg總RNA為例。在無RNase離心管中，加入0.5mg引物至含總RNA的樣品中，總體積不大于15ml。70℃，5分鐘打開模板鏈形成的二級結(jié)構(gòu)。立即放于冰上降溫防止二級結(jié)構(gòu)恢復(fù)，隨后短暫離心使液體集中在離心管底。

2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意：不要改變引物的加入比率。

M-MLV 5×Reaction Buffer：5ml

dATP，10mM：1.25ml

dCTP，10mM：1.25ml

dGTP，10mM：1.25ml

dTTP，10mM：1.25ml

Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor：25 units

M-MLV RT：200 units

無核酸水至最后體積 25ml

3）輕輕混勻離心管，如果使用隨機引物在37℃孵育60分鐘，其他引物則42℃孵育。延伸溫度在37～42℃之間優(yōu)良。

4）M-MLV RT 用于合成cDNA的第一鏈。往后的合成則需要根據(jù)需要自行設(shè)計引物再次合成。

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)Buffer組成

M-MLV RT 5×Reaction Buffer

250mM Tris-HCl（PH 8.3 室溫下）

375mM KCl

15mM MgCl2

50mM DTT

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)來源

大腸桿菌表達純化

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)保存條件

-20℃保存。避免經(jīng)常凍融。

操作步驟（僅供參考）：

一、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇：

（1）如果模板為真核生物來源，建議用Oligo(dT)16 ，Oligo(dT)16可以與真核生物mRNA 的3’Poly A 尾配對，可獲得高產(chǎn)量的全長cDNA。

（2）模板為原核生物RNA的反轉(zhuǎn)錄請選用Random引物或者基因特異性引物。

（3）Random引物適用于mRNA、tRNA 和rRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對物種沒有限制，病毒、細菌、植物、動物等都可使用。

1、在冰浴的無RNase的離心管中加入如下反應(yīng)成分：

1-5μg 總 RNA或50-500ng mRNA

2μLOligo(dT)16或 2μLRandom 或 2pmole 基因特異性引物

補RNase-free ddH2O 至 14.5μL

2、70℃保溫5min后迅速在冰上冷卻2min，簡短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分：

4μL：5×M-MLVBuffer

1μL：dNTPs

0.5μL：RNasin

1μL：M-MLV

 3、42℃溫浴60min，如果是用Random引物，請先將離心管置25℃溫浴10min，再42℃溫浴60min。

4、95℃加熱5min終止反應(yīng)，置冰上進行后續(xù)實驗或-20℃保存。

5、用RNase-free ddH2O 將反應(yīng)體系稀釋到50μL，取2-5μL進行PCR反應(yīng)。

二、PCR反應(yīng)

2、混勻后短暫離心，PCR儀擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

注意事項：

1、用于cDNA合成反應(yīng)的相關(guān)試劑和耗材盡可能用DEPC進行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時，首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進行過濾除菌處理。

2、試劑盒的各組分應(yīng)在-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

3、RNA樣品要避免反復(fù)多次凍融，應(yīng)使RNA在冰浴中處于融化狀態(tài)。

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) 核酸電泳

產(chǎn)品訂購信息：

RP9988  通用RT-PCR試劑盒(M-MLV) Universal RT-PCR Kit(M-MLV)  25T/50T/100T